Buněčná kultura v podstatě zahrnuje rozmístění buněk v umělém prostředí (in vitro), které je složeno z potřebných živin, ideální teploty, plynů, pH a vlhkosti, aby buňky mohly růst a množit se.

• In vivo – Pokud studiezahrnuje živé biologické entity v organismu.

• In vitro – Pokud je studie prováděna s použitím biologických entit (buněk, tkání atd.), které byly izolovány od jejich přirozeného biologického prostředí. Např. tkáň nebo buňkyizolované z jater nebo ledvin.

Když lze kousky tkáně vložit do vhodné kultury a získat tak buňky, které lze následně použít ke kultivaci (explantace), lze buňky z tkání (měkkých tkání) získat pomocí enzymatickýchreakcí. K rozkladu tkáně a uvolnění požadovaných buněk se používají takové enzymy jako trypsin a proname.

Pokud byly buňky získány přímoz organismu/živočišné tkáně (nebo dokonce z rostlinné tkáně) pomocí enzymatických nebomechanických technik, označují se takové buňky jako primární buňky. Avšak buňky, které pokračují v množení po neomezenou dobu (po první subkulturaci) za speciálních podmínek, se označují jako buněčné linie.

Tyto konkrétní buňky bývají pasážovány po dlouhou dobu, což způsobuje, že získávají homogenní (podobné) genotypové a fenotypové znaky.

Morfologie

Na základě vzhledu lze buňky v kultuře rozdělit do tří hlavních skupin:

• Fibroblastické – Patří sem buňky, které bývají bipolární/multipolární s protáhlým tvarem. Tyto buňky jsou při růstu přichyceny k podkladu.

• Epitheliální – Buňky podobné epiteliálním dosahují polygonálního tvaru s pravidelnými rozměry. Ačkoli mají tendenci růst v diskrétních políčkách, rostou tyto buňky také přichycené k substrátu.

• Lymfoblast – Tyto buňky mají obvykle kulovitý tvar a nepřichycují se k povrchu substrátu. V důsledku toho se pěstují v suspenzi.

* U pevných destiček se v případě použití tekutého média s agarem používají zpevňující látky (např. agar).

Význam buněčných kultur

Buněčné kultury jsou důležitou technikou v buněčné i molekulární biologii vzhledem k tomu, že poskytují nejlepší platformu prostudium normální fyziologie a biochemie buněk. Buňka je základnístrukturální, funkční a biologickou jednotkou všeho živého.

Pro pochopení organismu nebo daných tkání je důležité pochopit, jak jehobuňky fungují. Prostřednictvím buněčných kultur je to možné zejména díky tomu, že se primární buňky podobají rodičovským buňkám daného organismu/tkáně.

Cokoli se o buňkách in vitro dozvíme, je reprezentativní pro to, co se děje s organismem/tkání. To činí buněčné kultury významnědůležitými pro vývoj vakcín, screening (léků atd.) a diagnostiku daných onemocnění/stavů.

Vzhledem k tomu, že různé typy buněk vyžadují pro své množení různá prostředí, existují různé typy médií používaných pro kultivaci, jako jsou mimo jiné média bez séra a média obsahující sérum.

Po zajištění správných požadavků se počet buněk zvýší a mohou vytvořit kolonie, které pak lze snadno pozorovat a identifikovat.

To vše však vyžaduje, aby byl pochopen účel postupu.

Pokud dobře rozumíme tomu, čeho má být postupem dosaženo, je snazší připravit kulturu se správnými složkami. Pochopením toho, k čemu je postup zaměřen, bude výzkumník vědět, zda má připravit selektivní médium (které umožňuje růst specifických buněk) nebo diferentní médium (které umožňuje růst různých typů buněk).

Primární buněčná kultura

Buněčná kultura je proces, při kterém jsou buňky (živočišné nebo rostlinné) odebrány z organismu a zavedeny do umělého prostředí s příznivými podmínkami pro růst. To umožňuje výzkumníkůmstudovat buňky a dozvědět se o nich více.

Existují tři hlavní typy buněčných kultur, mezi které patří:

• Primární buněčná kultura
• Sekundární buněčná kultura a
• Buněčná linie

Zde se zaměříme na primární buněčnou kulturu.

Existují dva typy primárních buněk:

Adherentní buňky – označují se také jako buňky závislé na ukotvení, jedná se o typ buněk, které pro svůj růst vyžadují připevnění. Adherentní buňky jsou nepohyblivé a získávají se například z orgánů, jako jsou ledviny.

Suspendované buňky – Jedná se o typbuněk, které ke svému růstu nevyžadují přichycení. Proto se jim také říká buňky nezávislé na ukotvení a patří k nim takové buňky, jako jsoulymfocyty, které se nacházejí v krevním systému.

V primární buněčné kultuře se buňky získané ztakových rodičovských tkání (živých tkání), jako jsou játra a ledviny, zavádějí do vhodných médií pro růst. Jakmile jsou buňky získány, mohou být kultivovány jako explantátová kultura, suspenze nebo monovrstva.

* V primární buněčné kultuře musí být buňky získány z rodičovské/živé tkáně. To znamená, že nepocházejí z jiného kultivačního procesu.

Před kultivací se buňky nejprve podrobí enzymatickému ošetření za účelem disociace. Musí však trvat co nejkratší dobu, aby nedošlo k poškození nebo usmrcení buněk. Jakmile jsou jednotlivé buňky získány, jsou pak vhodně kultivovány v médiích, aby mohly růst (dělit se) a dosáhnout požadovaného počtu.

Zpočátku bývá kultura heterogenní v tom smyslu, že je složena z různých typů buněk získaných z tkáně.Ačkoli to lze udržet procesem in vitro (v kultuře ve vhodném médiu), bylo by to pouze po omezenou dobu.

Prostřednictvím transformačního procesu lze primární buňky používat po dlouhou dobu, čímž se kultura v průběhu času mění. Tyto buňky se označují jako kontinuální buněčné linie.

Primární buňky se však obvykle upřednostňují před kontinuálními buněčnými liniemi z toho důvodu, že jsou více podobné (fyziologicky) buňkám invivo (buňky z živé tkáně). Kromě toho kontinuální buněčné liniemohou projít určitými změnami (fenotypové a genotypové změny), které byvedly k nesrovnalostem při analýze. Proto je nelze použít k určení toho, co se děje s buňkami in vivo. Právě z tohoto důvodu se dává přednost primárnímbuňkám.

Vzhledem k tomu, že primární buňky se výrazněpodobají buňkám získaným z živé tkáně, jsou důležité pro výzkumnéúčely v tom, že je lze použít ke studiu jejich funkcí, metabolickýchregulací, fyziologie buněk, vývoje, defektů a podmínek ovlivňujících zájmovoutkáň.

Také se používají mimo jiné k takovým účelům, jako je výroba vakcín, screening léčiv genetického inženýrství a také testování toxicity a prenatální diagnostika.

Média pro buněčné kultury

Při technikách buněčných kultur jsou buňky (nebo tkáně)odebrány z rostliny nebo zvířete a zavedeny do nového, uměléhoprostředí, které může podporovat jejich proliferaci (přežívání a růst).

Některé z požadavků takového prostředí na proliferaci buněkzahrnují:

• Substrát (zdroj výživy)
• Ideální teplotní rozmezí (kontrolované)
• Růstové médium a
• Ideální pH mimo jiné

Tady, zaměříme na médium (kultivační médium pro buňky)

Ačkoli existují různé typy kultivačních médií (pro různé typy buněk), obvykle se skládají z:

• Glukóza
• Aminokyseliny
• Vitamíny
• Anorganické soli
• Připojovací faktory atd.

Existují dva hlavní typy kultivačních médií, mezi které patří:

Přírodní média – Přírodní kultivační média se skládají z biologických tekutin, které se vyskytují v přírodě. Přestože lze tento typ média použít pro celou řadu buněk, jeho největší nevýhodou je, že může postrádat přesné složky, které dané buňky vyžadují, což může značně ovlivnitreprodukovatelnost.

Umělé médium – Umělé médium, označované také jako syntetické médium, označuje typ média, které se vyrábí mimo jiné přidáním takových živin, jako jsou vitamíny, plyny (kyslík a oxid uhličitý) a bílkoviny. Tyto organické a anorganické živiny se přidávají tak, aby vyhovovaly specifickým potřebám daných buněk, a poskytovaly tak ideální prostředí pro jejich růst.

Jako takové mohou být použity pro řadu účelů, včetně:

• Zajištění okamžitého přežití buněk
• Zajištění prodlouženého přežití buněk
• Zajištění neomezeného růstu buněk
• Zajištění specializovanýchfunkcí

Na druhé straně lze kultury kategorizovatjako:

Selektivní média – jedná se o speciální typ média, které umožňuje růst pouze určitým buňkám. Například krevní agar (používaný k izolaci streptokoků & druhu Moraxella) lze přidáním antibiotik změnit na selektivní médium.

Diferencovaná média- Tento typ médií umožňuje růst různým typům buněk/mikroorganismů v závislosti na jejichmetabolismu.

Jak bylo uvedeno výše, různé typy syntetických médií se připravují tak, aby poskytovaly ideální proliferačníprostředí pro dané buňky. Z tohoto důvodu lze syntetická média rozdělit do čtyř hlavních kategorií.

Mezi ně patří:

Média obsahující sérum – V těchto typech médií se používá sérum (fetální hovězí sérum) jako nosič živin a růstových faktorů mimo jiné i těch, které bývají nerozpustné ve vodě.

Média bez séra – Tyto typy médií se typicky vyrábějí pro účely podpory jednoho typu buněčné kultury. jako taková poskytují specifikované živiny a další faktory požadované daným typem buněk. V těchto médiích se sérum nevyskytuje, protože představuje určité nevýhody a může vést k nesprávné interpretaci imunologických výsledků.

Chemicky definovaná média – Jak název napovídá, tento typ médií se skládá z čistých organických a anorganických složek bez kontaminace. Složky tohoto typu médií jsou obvyklevyráběny pomocí genetického inženýrství u bakterií/kvasinek.

Bezproteinová média – Bezproteinová média obvykle neobsahují žádný typ bílkovin. Ve velké míře se používají k podpořelepšího růstu buněk i exprese proteinů, kromě toho usnadňují purifikaci jakéhokoli exprimovaného produktu.

Mezi hlavní složky médií pro buněčné kultury patří:

• Nutrienty – zajišťují je peptidy a aminokyseliny, které jsou stavebními kameny proteinů
• Sacharidy pro energii
• Esenciální minerály, jako je vápník, hořčík, fosforečnanya železo, mimo jiné pufrovací činidla, jako jsou acetáty pro stabilizaci kultivačního média
• Vitamíny
• Indikátory změny pH, jako je fenolová červeň

Kultivační média se používají proproliferaci buněk, které lze následně identifikovat a studovat. Jako taková mohou být použita pro různé účely, mimo jiné pro vzdělávání, diagnostiku a léčbu onemocnění.

Buněčná suspenze

V kultivačních metodách se buněčnou suspenzí označuje typ kultury, kdy jsou buňky suspendovány v tekutém médiu.

Pro získání jednotlivých buněk se křehký kalus (drobná tkáň, která se snadno rozpadá) vloží do míchaného tekutého média (mícháníumožňuje výměnu plynů na rozdíl od pevného média) a rozbije se. To umožňuje uvolnění jednotlivých buněk, které se pak přenesou do jiného čerstvého média.

Buněčné suspenzní kultury mají oproti stacionárním velkou výhodu v tom, že umožňují rovnoměrné omývání buněk. Navíc vzhledem k tomu, že médium bývá mícháno, umožňuje provzdušňování média,čímž se k buňkám dostávají plyny. Vzhledem k tomu, že médium je suspenzní, je také snadné manipulovat s obsahem kultury.

Stejně jako každá jiná kultura musí být i suspenzní buněčná kultura v kontrolovaných podmínkách, které buňkám poskytují ideální prostředí pro jejich množení. Jakmile dosáhnou přibližně 80 % konfluence, je čas na subkultivaci, aby se zajistil další správný růst.

* 80 % konfluence označuje stav, kdy je 80 % povrchu kultury pokryto rostoucími buňkami.

V některých případech mohou buňky v suspenzipřilnout k plastovému povrchu kultivační baňky nebo dokonce vytvořit shluky. V takových případech lze použít pipetu k zachycení těchto buněk a jejich vytlačení na povrch baňky, a tedy pryč z plastového povrchu. To pomáházískat jednotlivé buňky vzhledem k tomu, že neulpívají na plastovém povrchu.

Suspenze červených krvinek

• (vlevo: bez hemolýzy) suspenze červených krvinek (0,5% ovčích RBC ve fyziologickém roztoku), zdá se červená a neprůhledná.
• (uprostřed: bez hemolýzy) RBC sedimentovaly spontánně po dobu 60 min. Všimněte si, že supernatant není zbarvený.
• (vpravo: hemolýza) Suspenze RBC ošetřená hemolyzinem S. pyogenes při 37C po dobu 30 min, zprůhlední hemolýzou.

Více o červených krvinkách

Počítání buněk

Počítání počtu buněk v suspenzi je proces, který zahrnuje použití barviva. Například když se použije trypanová modř, pronikne do buněčné membrány mrtvých buněk, ale ne do živých.

Buňky se pak opatrně vypudí do hemocytometru (obsahuje počítací komůrku) pod krycí sklíčko a pozorují se pod mikroskopem. Buňkyse pak počítají v daném počtu čtverečků pro výpočty.

Význam

Tato metoda je do značné míry upřednostňována vzhledem k tomu, že umožňuje, aby buňky byly suspendovány v roztoku, a ne aby byly drženy v pevném médiu. Zde je tedy snazší manipulovat s obsahem, čímž se zabrání jejich shlukování. U buněčných suspenzí je také snazší pozorovat jednotlivé buňky pod mikroskopem.

V tomto případě je možné nejen studovat strukturu buněk, ale také sledovat, jak dobře se diferencovaly; prohlížet si mrtvé a živé buňky pod mikroskopem.

Protokoly buněčných kultur

Protokoly buněčných kultur mají zajistit, aby kultivační postupy byly prováděny podle požadovaných standardů. To má nejen zabránit kontaminaci buněk, ale také zajistit, aby byli samotní výzkumníci chráněni před jakoukoli formou kontaminace.

Mimo to se očekává, že povaha práce bude odpovídat příslušným etickým pravidlům. Proto je nezbytné přede vším ostatním zajistit, aby celý postup odpovídal jak lékařsko-etickým, tak i pokusným pravidlům pro pokusy na zvířatech. Je to proto, že porušení těchto právních předpisů a směrnic může mít za následek vysoké sankce a dokonce i uzavření laboratoře.

Před zahájením jakékoli práce proveďte následujícíproceduru:

• Ujistěte se, že pracovní prostorje vydezinfikován (pomocí 70 % etanolu)
• Vždy používejte nový pár rukavic. Pokud je třeba pár rukavic použít pro jiný postup kultivace buněk,měly by být dezinfikovány pomocí 70procentního ethanolu a ponechány uschnout na vzduchu.
• Všechno vybavení, které bylovyjmuto ze skříňky, by mělo být rovněž dezinfikováno, aby se zabránilo jakékoli kontaminaci
• Takové vybavení, jako jsou pipety, skleněné nádoby a plasty, které mají být použity pro postup, by měly být autoklávovány

Ačkoli existuje široká škála kultivačních médií pro buňky, je důležité mít na paměti, že buněčné kultury, a zejménaprimární buněčné kultury, jsou kromě rizika, že obsahují nezjištěné viry, snadno náchylné ke kontaminaci. Z tohoto důvodu by se s veškerým materiálem mělo zacházet jako s potenciálně infekčním, aby se předešlo případným infekcím.

Z bezpečnostních důvodů by se navíc práce s buněčnými kulturami měla provádět ve vhodné laminární digestoři, kde je vzduch odváděn od výzkumníka.

Protokoly pro přípravu buněčných kultur

Vždy zkontrolujte informace na obalu, abyste se ujistili, že médium je vhodné pro kultivované buňky,

Po přípravě, by měla být buněčná kultura udržována v doporučeném teplotním rozmezí,

Kontrolujte kulturu každých 30-48 hodin a zkontrolujte konfluenci (když buňky zcela pokryjí povrch kultury) – to však do značné míry závisí na typu buněk.

Po dokončení postupu a analýze buněk by měla být kultura vhodným způsobem zlikvidována. Zde je třeba dbát velké opatrnosti vzhledem k tomu, že v této době se již buňky rozmnožily a zvýšily svůj počet. Navíc existuje vysoká pravděpodobnost, že vzorek byl kontaminován, což zvyšuje riziko způsobení infekce výzkumníkovi, pokud se s ním nezachází vhodným způsobem.

Likvidace

• U takových předmětů, jako jsou mimo jiné skalpely,skleněná sklíčka a krycí sklíčka, může de-kontaminace zahrnovat autoklávování při teplotě 121 stupňů Celsia a tlaku 15 psi (tlak) po dobu nejméně 30 minut. Pokud však mají být zlikvidovány, je důležité, aby byly vloženy do plastového sáčku a do příslušného kontejneru, aby mohly být později spáleny.
• U kapalného odpadu je chemická dezinfekce jednou z nejlepších metod, kterou lze odpadní produkt deaktivovat. K tomuto účelu lze použít takové chemikálie, jako je bělidlo, před vylitím kapaliny do odtoku z dřezu.
• U pevných odpadů se produkty shromažďují do plastového pytle určeného ke spálení. Na druhé straně je lze před spálením nejprve autoklávovat.

Závěr

Všeobecně platí, že buněčná kultura, ať už jde o použití suspenze nebo stacionárního média, zahrnuje růst buněk v umělém prostředí s příznivými podmínkami. Zatímco enzymatické působení lze použít k získání buněk pro kultivaci, je to metoda mechanické disagregace, která je nejvíce upřednostňována vzhledem k tomu, že poskytuje jednodušší a méně traumatický způsob získání buněk.

Tato metoda jednoduše spočívá v nakrájení tkáně na menší kousky, ze kterých se pak sbírají vylité buňky. K získání buněk lze použít také techniku primárních explantátů. Tato metoda je však většinou užitečná pro rozdělení menšího množství tkáně.

Ačkoli lze v kulturách použít jakékoliv buňky a sledovat jejich chování, dává se přednost embryonálním tkáním (pro primární buňky) ve srovnání s buňkami dospělých, protože poskytují buňky, které jsou životaschopnější a mohou se rychle množit.

Je také důležité zajistit, aby buněk bylo větší množství vzhledem k tomu, že jejich míra přežití bývá nižší ve srovnání s dílčími kulturami. I

Pro zvýšení úspěšnosti kultur je také důležité zajistit, aby se minimalizovalo poškození buněk jak při odběru, tak při zpracování. To je kromě použití vhodného média pro dané buňky.

Podle stejného vzoru se podívejte na typy a techniky tkáňových kultur.

Podívejte se na výběr příslušenství k mikroskopům od MicroscopeMaster.

Stejně jako informace o buněčném dělení, buněčné diferenciaci a barvení buněk a získáte přehled o teorii buněk.

Pro pokročilejší a skvělé čtení je Molekulární biologie buňky. Stejně jako informace o cytochemii.

Možná jste student, učitel nebo hobbyista a chcete sledovat informace MicroscopeMaster o zábavných mikroskopických experimentech.

Podívejte se také na Mikroskopické kultury a testování citlivosti

Zpět z Buněčné kultury na hlavní stránku Buněčná biologie

Zpět z Buněčné kultury na hlavní stránku MicroscopeMaster

.