3 Inhibitory amylázy

α-amyláza (1,4-α-d-glukan-glukanohydroláza, EC3.2.1.1) je endoglukanáza, která katalyzuje hydrolýzu endo α-(1,4) glykosidických vazeb ve škrobu a příbuzných polysacharidech. Hydrolýzu škrobu nejprve katalyzuje α-amylasa přítomná v lidských slinách a poté pankreatická amylasa v dvanáctníku. Lidská pankreatická α-amylasa (HPA) je důležitým farmakologickým cílem pro léčbu diabetu 2. typu. Náklady na HPA jsou však pro výzkumné účely poměrně vysoké. Místo toho se při měření trávení in vitro používá prasečí pankreatická α-amyláza (PPA). PPA se skládá ze 496 aminokyselinových zbytků a vykazuje 83% identitu se svým lidským protějškem HPA (Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986). PPA je amyláza endo-typu a katalyzuje hydrolýzu vnitřních α-(1,4) glykosidických vazeb v amylóze a amylopektinu vícenásobným atakem směrem k neredukujícímu konci (Robyt & French, 1970). Produkty hydrolýzy prasečí pankreatické α-amylázy jsou především maltóza, maltotrióza a maltotetrióza (Yook & Robyt, 2002). PPA má dva izomery PPA isozym-I (PPA-I) a PPA-II, které mají stejnou molekulovou hmotnost, ale mírně se liší složením aminokyselin a izoelektrickým bodem (Pasero et al., 1986).

Mezi přirozeně se vyskytující inhibitory α-amylázy patří inhibitory na bázi proteinů a sekundární metabolity. První jmenované jsou mimo rámec tohoto článku, protože mají tendenci denaturovat při tepelném nebo kyselém (žaludeční kyselost) ošetření a ztrácejí svou aktivitu, když se dostanou do tenkého střeva. V tomto článku shrnujeme nejnovější literární údaje o inhibitorech α-amylázy. Uvádíme také metody použité při měření jejich inhibiční aktivity, protože různé metody mohou vést k různým hodnotám IC50. Ve srovnání s α-glukosidázou je u α-amylázy méně zpráv a většina studií se týká polyfenolů.

Isookanin (57) (obr. 3.8) izolovaný z jehlice španělské, Bidens bipinnata, vykazoval mírnou inhibiční aktivitu na HPA (IC50 0,447 mg/ml nebo 156 μM) měřenou pomocí jodometrického testu (Yang et al., 2012). Je třeba poznamenat, že isookanin obsahuje dvě katecholové jednotky, a proto se očekává, že je dobrým reduktantem, který může redukovat jod způsobující falešně pozitivní výsledky.

Obrázek 3.8. Chemické struktury inhibitorů amylázy, sloučenin 57-59, kyseliny 5-kafeoylchinové a kyseliny 4,5-dikafeoylchinové.

Z listu vodního listu (Syzygium aqueum) byly získány myricetin-3-O-rhamnosid (9) a europetin-3-O-rhamnosid (10) (obr. 8). 3.2) byly izolovány a jejich inhibiční aktivita na inhibici α-amylázy byla měřena pomocí testu DNSA a byla desetkrát silnější (EC50 ~ 2,0 μM) než u akarbosy (EC50 19 μM). Takto vysoká aktivita je u polyfenolických sloučenin pozorována poměrně zřídka a zasluhuje si další zkoumání, zejména pokud jde o mechanismus jejich inhibice a selektivitu při působení těchto sloučenin na komplexní potravinovou matrici. Myricetin je silný zachycovač radikálů, a proto je také otázkou stabilita 9 a 10. Autoři uvádějí, že kvercetin má srovnatelnou EC50 (17 μM) jako akarbosa (19 μM). Pomocí zákalového testu, který jsme vyvinuli v naší laboratoři, jsme nezjistili žádnou inhibiční aktivitu kvercetinu vůči pankreatické α-amyláze při použití akarbosy jako referenčního standardu (Huang et al., nepublikované výsledky). Proto je třeba ověřit, zda je uváděná hodnota EC50 závislá na metodě, aby se vyloučil možný artefakt (Manaharan et al., 2012). Cleistocalyx operculatus patří také do čeledi Myrtaceae. Hu, Luo, Li, Joshi a Lu (2012) izolovali a purifikovali 2′4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′5′-dimethylchalkon (DMC) ze sušených květních pupenů C. operculatus. Sloučenina vykazovala nekompetitivní inhibiční mechanismus vůči PPA (Hu et al., 2012).

Tilirosid (58) (obr. 3.8), izolovaný ze semen růže psí, Rosa canina L., inhibuje PPA s IC50 280 mM a kinetická studie ukazuje, že se jedná o nekompetitivní inhibitor s hodnotami Ki 84,2 μM kvantifikovanými pomocí p-nitrofenyl-alfa-d-pentaglukosidu jako substrátu. Na rozdíl od akarbosy nevykazuje tilirosid inhibiční aktivitu vůči α-glukosidase. Snad vzhledem k jeho slabé inhibiční aktivitě vůči α-amyláze na zvířecím modelu je ke snížení postprandiální koncentrace glukózy v plazmě myší, kterým byl podáván škrob v dávce 2 g/kg, zapotřebí vysokých dávek tilirosidu (600 mg/kg). Tilirosid může vykazovat antihyperglykémii prostřednictvím inhibice jak sodíkem závislého glukózového transportéru 1, tak glukózovým transportérem 2 zprostředkovaného vychytávání glukózy v enterocytech (Goto et al., 2012).

Kurkumin a jeho deriváty jsou podle předpokladů sloučeniny s více cíli, které mají velmi široké spektrum zdravotních účinků. Jako potenciální látka pro zmírnění rychlosti trávení škrobu má bisdemethoxykurkumin (59) (obr. 3.8) z oddenku Curcuma longa inhibiční aktivitu HPA a PPA s hodnotami IC50 přibližně 25 μM pomocí testu DNSA. Kinetická studie ukazuje, že se jedná o nekompetitivní inhibitor HPA se zdánlivým Ki 3,0 μM (Ponnusamy et al., 2012).

Mono- a disubstituované kafeoylchinové kyseliny jsou hlavními polyfenolickými sloučeninami obsaženými v zelených kávových zrnech. Vzhledem k přítomnosti tří sekundárních hydroxylových skupin v kruhu kyseliny chinové existují tři vzájemně se měnící polohové izomery monosubstituovaných kafeoylchinových kyselin a tři dikafeoylchinové kyseliny, které byly všechny purifikovány ze zelených kávových zrn. Jejich inhibiční aktivita na PPA-I (Narita & Inouye, 2011) byla měřena pomocí p-nitrofenyl-diglukosidu, při jehož hydrolýze vzniká p-nitrofenol a maltóza. Je pozoruhodné, že inhibiční aktivita je vysoce závislá na poloze kafeoylových skupin v monokafeoylchinové kyselině. Kyselina 5-kafeoylchinová (nebo obecně známá jako kyselina chlorogenová) (obr. 3.8) má vyšší inhibiční aktivitu s IC50 80 μM ve srovnání s kyselinou 4-kafeoylchinovou (120 μM) a kyselinou 3-kafeoylchinovou (230 μM). U tří izomerů kyseliny dikafeoylchinové je inhibiční aktivita mnohem vyšší a nejsou tak citlivé na polohu esterových skupin, protože 3,4- a 4,5-dikafeoylchinové kyseliny (obr. 3.8) mají stejné hodnoty IC50 (20 mM) a 4,5-dikafeoylchinová kyselina má IC50 30 μM (Narita & Inouye, 2011).

.