Abstract

La infección crónica activa por el virus de Epstein-Barr (CAEBV) es una enfermedad grave con una activación inusual del VEB que persiste durante años, y su patogénesis es en gran medida desconocida. Tras la creación de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa preciso y reproducible para cuantificar el ADN del VEB, se determinaron las cargas del virus en los linfocitos de sangre periférica (LPS) en 54 niños: 15 con CAEBV, 16 con mononucleosis infecciosa (MI) y 23 niños sanos. Los niños con CAEBV y los que tenían MI presentaban cargas víricas elevadas. Se detectaron cargas más bajas en el 47% de los donantes seropositivos. Había dos diferencias claras entre los niños con CAEBV y los que tenían MI: Los primeros tenían una mayor replicación viral (103-107 copias/PBL)2,5 × 105 PBL) que los que tenían IM, y la replicación viral disminuyó en los niños con IM mientras que la replicación activa persistió durante años en los sujetos con CAEBV. La persistencia de cargas virales elevadas es un posible criterio de diagnóstico del CAEBV. Las cargas de VEB pueden permitir la clasificación y el pronóstico de las infecciones por VEB.

El virus de Epstein-Barr (VEB) es un agente causante de la mononucleosis infecciosa (MI) y de la infección crónica activa por VEB (CAEBV). El CAEBV es una enfermedad grave con una activación inusual del VEB que puede ser mortal con fallo orgánico múltiple, y se asocia a un linfoma maligno sin inmunosupresión previa . Los síntomas clínicos del CAEBV y las anomalías serológicas correspondientes a la replicación activa del VEB, como los anticuerpos anti-EA-DR notablemente elevados y la ausencia de anticuerpos contra el antígeno nuclear de Epstein-Barr (EBNA), persisten durante meses o años. El VEB se replica en los linfocitos NK, T y B.

Una vez establecida la infección, el VEB suele residir en los linfocitos B durante toda la vida del huésped sin causar ningún síntoma clínico (lo que se denomina infección latente). Por lo tanto, no sólo la detección sino también la cuantificación del VEB en los tejidos afectados es esencial para investigar la enfermedad por el VEB.

Para aclarar el estado de la replicación del VEB en personas con CAEBV, utilizamos la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) semicuantitativa del ADN para evaluar y comparar las cargas del virus en los linfocitos de la sangre periférica (PBL) en 3 grupos de niños: uno con CAEBV, otro con IM y controles sanos. Nuestro sistema de detección se consideró preciso y fiable para la cuantificación del VEB porque amplificamos una región de una sola copia del VEB. La mayoría de los estudios anteriores se centraron en la región BamHI-W, cuya frecuencia de reiteración en tándem es inconstante. Creemos que este estudio es el primero y más amplio de las cargas de virus en PBL de niños con CAEBV.

Materiales y métodos

Pacientes y controles

Examinamos a 16 niños con MI (11 niños, 5 niñas; edades, 0-8 años), 15 con CAEBV (11 niños, 4 niñas; edades, 4-19 años), 19 personas sanas inmunocompetentes al VEB (10 niños, 9 niñas; edades, 1-19 años), y 4 niños sanos seronegativos (3 niños, 1 niña; edades, 1-10 años). Todos los sujetos con MI presentaban manifestaciones clínicas típicas (por ejemplo, fiebre, amigdalitis, linfadenopatía, hepatoesplenomegalia, disfunción hepática y linfocitosis atípica). El diagnóstico de MI se hizo sobre la base de los hallazgos serológicos de anticuerpos IgM contra el antígeno de la cápside viral (VCA) o la seroconversión de VCA IgG y/o EA y anticuerpos EBNA negativos. Se tomaron 22 muestras de sangre de 16 niños con MI entre 8 días y 8 meses después del inicio de la enfermedad (el síntoma inicial fue la fiebre en todos los pacientes). El CAEBV se diagnosticó según los criterios de Rickinson. Los niños con CAEBV tenían fiebre intermitente o persistente durante >16 meses, con hepatoesplenomegalia, linfadenopatía y/o erupción cutánea. Los resultados de laboratorio mostraron niveles elevados de transaminasas, anemia, trombocitopenia y/o hipergammaglobulinemia policlonal. El examen serológico reveló una marcada elevación de los títulos de anticuerpos contra la AVC y la EA. Se excluyeron la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana y las enfermedades reumáticas. Ningún sujeto había sido sometido a un trasplante ni había recibido tratamiento anticanceroso.

Muestras

Se recogieron muestras de sangre periférica de 2 mL, paridinizadas. Los PBL se aislaron mediante ficol-hipo y se lisaron con 0,15 μg/μL de proteinasa K (Boehringer-Mannheim, Indianápolis); el ADN se extrajo con precipitación de fenol-cloroformo-etanol. El ADN extraído se cuantificó mediante espectrofotómetro, se ajustó a 0,25 μg/μL de ADN y se utilizó como plantilla de la PCR.

Sensibilidad de la PCR

El ADN del VEB procedía de tres fuentes: Raji, que contenía 50 copias de VEB por célula ; Akata, que contenía 20 copias por célula; y fragmentos clonados de BamHI-L, que se mezclaron con ADN de células de sangre de cordón umbilical y se utilizaron como estándar positivo. Para determinar la sensibilidad del sistema de PCR, se sometieron a PCR diluciones seriadas de 10 veces (10°-104 copias del VEB) del ADN extraído.

PCR

Se diseñó una PCR doble anidada para amplificar la región conservada que codifica la gp220 (dentro del fragmento BamHI-L) . El par de cebadores externo amplifica un fragmento de 302 pb, utilizando los oligonucleótidos 5′-GCGAACTGGTGGACATGA y 5′-AA-GTCCACGCAAATGCCA, correspondientes a las posiciones 2870-3171 de B95-8 (GenBank M10593). El par interno amplifica un fragmento de 239 pb. La PCR se realizó en una reacción de 50 μL que contenía 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTP, 0,5 μM de cada cebador, 2,5 U de Taq ADN polimerasa (Boehringer-Mannheim) y 4 μL de ADN de la muestra. Los productos amplificados se corrieron en agarosa al 2% y se tiñeron con bromuro de etidio, y se utilizó Southern blot para confirmar la especificidad utilizando el fragmento BamHI-L como sonda . Cada reacción de PCR se realizó por triplicado e incluyó el control negativo para excluir la contaminación cruzada. Para confirmar la especificidad de la PCR, se analizó el ADN de los tipos 1 y 2 del virus del herpes simple, del virus de la varicela-zóster, del citomegalovirus humano y de los herpesvirus humanos 6 y 7. No se observó ninguna amplificación específica.

Cuantificación del genoma del VEB

La cantidad de ADN del VEB en PBL se determinó mediante experimentos de dilución limitante. Diluciones seriadas de 10 veces (1-10-6μg) de ADN genómico extraído de cada muestra de ADN se sometió a la PCR anidada como se ha descrito anteriormente, y el límite mínimo para el resultado positivo se convirtió en la carga del virus (copias/2,5 × 105 células).

Resultados

La sensibilidad del sistema de PCR se determinó cuidadosamente mediante diluciones de 10 veces de las tres fuentes de ADN del VEB: Raji y Akata, ambas con un número constante de copias de ADN del VEB por célula, y el fragmento BamHI-L clonado. Raji contiene 50 copias del genoma del VEB por célula, y 1 μg de ADN genómico de células Raji equivale al extraído de 2,5 × 105 células: por tanto, 1,25 × 107 copias de ADN del VEB. El ADN de Raji se diluyó adecuadamente, y el ADN que contenía 10n copias (diluciones en serie de 10°-104 copias del virus) se sometió a amplificación. Se examinó el límite mínimo para un resultado positivo de la PCR. Los exámenes repetidos revelaron que la sensibilidad era de 100 copias por reacción con reproducibilidad. Los resultados fueron los mismos utilizando ADN de Akata y con el experimento de dilución utilizando 10n copias de fragmentos de BamHI-L mezclados con 105μg, 102μg y ningún ADN de células de sangre del cordón umbilical.

Todos los PBL de sujetos con MI y CAEBV fueron positivos para el genoma del VEB. Nueve (47%) de las 19 muestras de personas sanas seropositivas al VEB fueron positivas. Todos los PBL de personas seronegativas fueron negativos.

El ADN del VEB en los PBL fue cuantificado y comparado para los controles sanos seropositivos al VEB, los niños con MI y los niños con CAEBV (figura 1). En los niños sanos seropositivos al VEB, las cargas del virus eran de 100-1000 copias por 2,5 × 105 PBL. En los PBL de niños con MI, los límites más bajos para los resultados positivos de la PCR oscilaron entre 10° μg (2,5 × 105 PBL) y 10∼3μg (2,5 × 102/PBL)de ADN genómico, lo que indica que la carga del virus era de 100-100.000 copias/2,5 × 105 PBL. Tres muestras de sangre recogidas un mes después de la aparición de la enfermedad albergaban cargas más elevadas (1000-100.000 copias/2,5 × 105 PBL). Las muestras de PBL recogidas >11 meses después del inicio de la MI tendían a contener cantidades reducidas del virus. Se realizó un seguimiento de las cargas víricas en 4 pacientes con MI (figura 2A). En los 4, las cargas del virus disminuyeron durante el curso clínico, pero fueron más altas (100-10.000 copias/2,5 × 105 PBL) que en los huéspedes seropositivos.

Los PBL de niños con CAEBV tenían más ADN del VEB que las muestras de niños con MI. Cuatro pacientes con CAEBV fueron seguidos durante >16 meses (la figura 2B ilustra los resultados de 2 pacientes). Otros dos pacientes tuvieron cargas virales sin cambios durante 2-3 años (105 y 106 copias/2,5 × 105 PBL, respectivamente). Todos estos pacientes presentaban cargas víricas persistentemente elevadas, a diferencia de los resultados obtenidos con la MI. Cuando examinamos la relación entre las manifestaciones clínicas y las cargas del VEB, sólo la fiebre se correlacionó con la carga del virus. No hubo correlación con la hepatoesplenomegalia, la linfadenopatía, el exantema, la alergia a los mosquitos, la disfunción hepática, la anemia, la trombocitopenia o los títulos de anticuerpos séricos contra el VCA, el EA-DR y el EBNA.

Discusión

La PCR que cuantificaba el ADN del VEB demostró que los PBL de los niños con CAEBV o MI tenían cargas virales elevadas, lo que indicaba una replicación activa del VEB en los linfocitos. La replicación viral se consideró más activa en el CAEBV que en la MI; en el grupo de la MI la replicación disminuyó gradualmente, mientras que la replicación activa persistió durante años en los pacientes con CAEBV.

Nuestro sistema de PCR amplifica las secuencias específicas del VEB que codifican la gp220, que es un gen de una sola copia en un virus, mientras que los estudios anteriores se dirigieron a la repetición interna larga situada en la región BamHI-W. Dado que en la proliferación policlonal del VEB el número de repeticiones de esta región es inconstante, nuestro sistema se considera más preciso para cuantificar el VEB, aunque menos sensible para su detección. El defecto de la baja sensibilidad se superó mediante el uso de la PCR anidada. La sensibilidad fue de 100 copias por reacción, en comparación con las 10 copias del informe anterior. Cuantificamos los genomas del VEB en PBL mediante la dilución en serie del ADN extraído. Nuestro sistema de cuantificación del ADN del VEB mediante diluciones seriadas del ADN extraído demostró ser reproducible y fiable.

Los PBL recogidos de niños con MI y con CAEBV albergaban mayores cantidades del genoma del VEB que los PBL de controles seropositivos sanos. De estos últimos, el 47% tenía ADN del VEB detectable (100-1000/2,5 × 105 PBL). En 2 sujetos se detectó el VEB a niveles más altos que en los estudios anteriores (1-50/106 PBL) . Dado que estudiamos a niños, los períodos más cortos después de la infección primaria pueden contribuir a las cargas de VEB más elevadas que las observadas en estudios anteriores de adultos, lo que nos recuerda que, especialmente en los niños, los resultados positivos de la PCR incluyen la infección asintomática latente por el VEB.

Los niños con MI tenían grandes cantidades de VEB. Las cargas de VEB alcanzaron su punto máximo un mes después del inicio (1000-100.000 copias/2,5 × 105 PBL) y luego disminuyeron gradualmente, pero siguieron siendo altas varios meses (⩽8) después del inicio, en comparación con los niveles de los controles sanos. Incluso cuando las manifestaciones clínicas desaparecieron, los niveles relativamente altos de replicación del VEB continuaron en los PBL.

Los pacientes con CAEBV tenían cantidades persistentemente grandes de VEB, lo que sugiere que la replicación activa crónica no regulada del VEB en los PBL da lugar a una enfermedad grave con un mal pronóstico. Los factores y mecanismos que conducen a la replicación viral sorprendentemente activa siguen sin estar claros. Se han descrito varias deficiencias heterogéneas en los sistemas de defensa del huésped, tanto de la inmunidad humoral como de la celular, que podrían permitir la replicación viral activa. En la enfermedad linfoproliferativa postrasplante (PTLD) asociada al VEB, una complicación después de los trasplantes, se ha demostrado una alta carga viral en la PBL (>1300.000 VEB/105 PBL), aunque las cargas virales disminuyeron en un año en paralelo a la recuperación de la inmunosupresión. Una diferencia cuantitativa en la carga circulante del VEB se correlacionó con el nivel de anticuerpos contra el EBNA en la PTLD pero no en el CAEBV. Por lo tanto, se consideró que el comportamiento del VEB en la PTLD era a la vez similar y diferente al del CAEBV. A la vista de las manifestaciones clínicas, el CAEBV parece similar al síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X (XLP), cuyo gen responsable se ha identificado recientemente. Sin embargo, a diferencia del síndrome XLP, el CAEBV no es una enfermedad hereditaria y puede afectar a las mujeres. Es necesario realizar más análisis inmunológicos del CAEBV para aclarar los factores que predisponen a la activación viral.

Se han utilizado el aciclovir, el interferón-α y la interleucina-2 para tratar el CAEBV, con resultados insatisfactorios. Nuestros resultados indican que los fármacos citotóxicos que inducen inmunosupresión y potencian la activación viral deben elegirse con cuidado, aunque las características clínicas son similares a las de las neoplasias hematológicas. La persistencia de cargas elevadas de VEB en la leucemia linfática pélvica es un posible criterio de diagnóstico del CAEBV y puede ser útil para supervisar la actividad de la enfermedad, para clasificar la enfermedad y para predecir el pronóstico.

Agradecimientos

Damos las gracias a George Klein (Centro de Microbiología y Tumorología, Instituto Karolinska, Estocolmo) por revisar el manuscrito y a Sachi Takemoto y Ai Kitamura por su hábil asistencia técnica.

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